ProteoCraft：从提案到验证，破解蛋白质设计搜索空间难题

蛋白质设计最难啃的骨头之一，就是序列搜索空间太大。

一条 100 个氨基酸的蛋白质序列，每个位置若都能从 20 种氨基酸里挑，理论上组合数超过 ，比可观测宇宙的原子总数还多。计算设计要干的，就是从这堆可能性里找出能折叠成预期结构、还能实现特定结合功能的序列。

斯坦福大学 X-lab 和 SNAP 实验室近日联合发布蛋白设计框架 ProteoCraft。它盯住序列搜索与结构验证，给出「提案 — 验证」方案：先用近似梯度提出修改方向，再用完整结构预测验证候选，随后由树搜索组织后续探索和单点精修。结合蛋白的从头设计能做，限定区域内的局部改造也能做。

计算基准里，ProteoCraft 在独立 AF2-IG 评估下的严格通过率是 86.2%；换成相同候选预算、ESMFold2 严格标准，树搜索的高置信度通过率达到 54.3%，为 Best-of-N 对照的 2.85 倍。

PD-L1 微型蛋白湿实验方面，35 个成功表达的候选中有 29 个结合命中，命中率 82.9%；6 个候选的报告所选拟合 Kd 低于 10 nM，最佳单次 SPR 拟合 Kd 为 0.879 nM。Big 配置比自身未优化版本平均快 3.57 倍，端到端搜索加速。

从计算评估走到湿实验，ProteoCraft 已经拿出有竞争力的阶段性成绩。那它到底怎么靠梯度提案、完整结构验证和两阶段树搜索，在庞大的序列空间里更有效地探索、精修候选？

从生成到搜索，ProteoCraft 如何寻找更优的蛋白质序列？

蛋白质结构生成与序列优化这块，眼下已经有好几条有代表性的技术路线。

RFdiffusion、BindCraft、BoltzGen 等方法已能从零生成蛋白结合分子，BindCraft 等也用过结构预测梯度来优化序列。可序列空间实在太大，搜索效率、计算开销和预测模型偏差仍是难题。

ProteoCraft 的核心思路，是把「提出修改」和「评价候选」拆开处理，再让两边在搜索过程里一直配合。

Proposal 阶段，近似梯度负责给出值得一试的修改方向；到了 Verification 阶段，模型对实际生成的离散氨基酸序列跑完整结构预测，看候选值不值得继续探索。

验证结果还会回传给树搜索，影响下一步设计决策。这样完整结构预测就参与整个设计过程，不再只用于最后筛选。

ProteoCraft 的提案 — 验证搜索流程，涵盖梯度提案、两阶段树搜索和完整结构预测。

这种分工对应两类不同的计算任务。

第一类，是怎么低成本确定序列该往哪个方向改。

对蛋白质设计来说，任何一个氨基酸位置变动，都可能牵动折叠结构以及它与靶点的相互作用。每次尝试都跑完整结构计算，搜索成本会很快堆上去。

所以 ProteoCraft 把多种信号合在一起指导序列修改。

它一边利用蛋白序列先验，判断新的氨基酸组合是否符合蛋白质序列的统计规律；一边借助残基间的几何约束，鼓励设计形成合理的内部结构和结合界面。

模型还引入了截断扩散梯度，用来获取与三维结构变化相关的修改信号。

为压住梯度计算成本，ProteoCraft 只对末端的一步去噪保留扩散路径梯度，不对完整扩散生成轨迹做反向传播。

不过，梯度给出的修改方向，并不直接等于候选的最终质量。

所以 ProteoCraft 还留了完整的结构验证环节。

对提出的离散候选序列，模型运行完整的 ESMFold2 结构预测，再结合界面置信度、蛋白质折叠置信度及整体结构质量等指标来评价。

近似梯度负责找可能有价值的方向，完整预测负责检验实际候选，避免只靠近似梯度评分就判定某条序列的价值。

提案、验证之外，还有一个问题：算力该往哪些候选上投？ProteoCraft给出的答案是蒙特卡洛树搜索，走的是由粗到细的两段路。

第一段叫 Stage A，一次允许改动多个氨基酸位点，任务就是大范围铺开试探，在广阔的序列空间里试各种组合，找出有潜力的设计区域。搜索时，模型按已通过验证的候选好坏来判断哪些分支还值得往下走，同时给没试够的方向留出机会。

第二段 Stage B 换成单点精修。拿到质量不错的候选之后，模型转入更细的局部优化，每一步只动一个氨基酸位置，在原有方案上继续调。

梯度提案、完整验证、树搜索决策，这三件事被串成一个迭代流程，算力就在大范围探索和局部打磨之间分配。

该框架也能做指定区域的可控设计。研究团队把可变序列区域和目标结合热点指定出来，用于以 T 细胞受体（TCR）为靶点的结合蛋白设计，以及 CDR/TCR 的局部改造。

做局部改造时，模型只更新被允许改动的残基，其余序列原样不动，但仍要参与整个复合物的结构预测。因此，ProteoCraft 既能在从头设计里找新的结合蛋白序列，也能守住已有分子框架、只对特定区域做精细调整。

86.2% 严格通过率、2.85 倍高置信度候选，ProteoCraft 展示搜索优势

论文从独立计算评估、搜索策略消融、推理效率几个方面系统测试了这套方法。先看从头结合蛋白设计任务上的性能对比。

这组计算基准涵盖 8 种靶蛋白、14 种靶点及结合热点设置，其中包括针对同一蛋白不同表位做设计。每种方法各出 210 个候选，用统一流程评估比较。

候选置信度与所报告计算耗时之间的关系。

团队不想让参与搜索的模型自己给自己打分，于是引入独立的结构预测评估工具 AF2-IG。这组测试里，ProteoCraft 的严格计算通过率达到 86.2%（181/210）。

对照方法的成绩是：BindCraft 49.5%，BindCraft v2 58.1%，PXDesign-d 9.5%。按本次统一评估标准，ProteoCraft 有更高比例的候选达到了指定的结构与结合界面置信度要求。

独立 AF2-IG 评估下，ProteoCraft 的严格通过率为 86.2%。

AF2-IG 没有参与 ProteoCraft 的候选搜索与选择，它用另一套结构预测模型把输出的序列重新查一遍，这样就能减少只靠搜索模型自身评分带来的评估偏差。

团队还用 Rosetta 评估了结合界面的能量、形状互补性、氢键和其他结构指标。相同评估流程下，ProteoCraft 的平均界面能量评分为 -81.195，BindCraft 为 -57.879；平均界面氢键数量分别是 12.510 和 8.500。

这些独立评估从侧面说明，ProteoCraft 在计算设计质量上有不错的表现。相关结果由独立的 AF2-IG 和 Rosetta 计算评估给出。

论文不只拿它和其他方法比，还单独考察了树搜索策略本身的作用。在 ESMFold2 设定的严格联合标准下，一个候选得同时满足 Pair iPTM 不低于 0.75、Binder pLDDT 不低于 0.9，才算通过。

跑完整套树搜索，210 个候选里有 114 个达标，通过率 54.3%。作为对照的 Best-of-N 用同样的提案机制、同样的候选预算，但不加树搜索控制，结果只有 40 个候选过关，比例 19.0%。两边通过严格标准的候选数量差了 2.85 倍。

这组对照表明，候选预算固定时，树搜索能让更多设计同时满足界面与折叠置信度的要求。团队还用消融实验逐一检验了各项技术设计的贡献。

把截断一步扩散梯度去掉后，模型的平均 Pair iPTM 出现下降，达到较高界面置信度标准的候选数量也跟着变少。这说明该信号能给序列修改补充额外的结构信息。

ESMFold2 评估与搜索策略消融的结果是：完整树搜索严格通过率 54.3%，Best-of-N 为 19.0%。

两阶段搜索里的单点精修，论文也单独做了对照。研究人员让不同搜索策略从同一个 Stage A 检查点出发，各给 40 个追加搜索步数：一组接着做多位点探索，另一组切到 Stage B 单点精修。

结果是，继续多位点探索的严格通过率为 40.5%，转去单点精修的那组达到 54.3%。追加搜索预算相同，单点精修拿到的严格达标候选比例更高，说明局部优化阶段在当前测试条件下有独立贡献。

这种能力在局部 CDR 改造任务里同样能看出来。以 1QRN β 任务为例，ProteoCraft 的 Peptide Pair iPTM 为 0.789，RFdiffusion v3 是 0.421；这个指标衡量的是设计区域与目标肽之间的预测界面置信度。再结合 AF2-IG 和 Rosetta 的独立交叉评估，结果进一步显示出该框架在限定序列区域内做精细设计的潜力。

TCR-facing binder 设计的 ESMFold2 与 AF2-IG 计算评估。

局部 CDR 改造的计算评估，涵盖 1QRN β 任务。

局部 CDR 改造的 AF2-IG 与 Rosetta 独立交叉评估。

除了候选质量，ProteoCraft 在计算效率上也做了优化。论文借助 Anthropic 开源的 ESMFold2 推理优化工具，测试了多种加速配置。在覆盖 13 个测试靶点的实验中，Big 配置相比未优化的 ProteoCraft，端到端搜索平均快了 3.57 倍。

Big 配置下，平均 Pair iPTM 是 0.673，未优化基线为 0.657，设计质量整体拉不开差距。Fast 配置则把平均加速拉到 3.68 倍，9C3E 任务上最高 6.78 倍；代价是平均 Pair iPTM 只有 0.628，低于 Big 配置和未优化基线。

速度和质量的取舍就摆在这里：Fast 能让部分任务跑得更快，可平均设计质量跟着往下走。论文因此更看重 Big 配置，认为它在搜索速度和平均设计质量之间更为均衡。

图示为 ESMFold2 不同推理配置的端到端加速表现，基线是未优化 ProteoCraft；另一张图对应不同推理配置在设计质量与搜索速度之间的取舍。

论文统计显示，从头设计任务里，ProteoCraft 每产出一个满足 overall iPTM 大于 0.70 的独特候选，摊销计算耗时 32.34 秒。

35 个候选命中 29 个，AI 设计的蛋白质走进真实实验

算完还不够，候选能不能真的结合靶蛋白，得靠实验说话。一条序列在结构预测里界面置信度再高，也不代表它能被顺利制备，更不代表实验中一定能与目标结合。团队因此在计算评估之外又做了湿实验验证。

团队提供的最新实验结果显示，这轮测试覆盖 PD-L1 微型蛋白、IFNAR2 微型蛋白和 IFNAR2 纳米抗体三组设计。三组当中，PD-L1 组的结合命中率最高。

PD-L1 在免疫调节中扮演重要角色，也是肿瘤免疫治疗领域被广泛研究的靶点。团队先针对它验证：计算设计得到的候选，能否在实验中真正形成结合。

ProteoCraft 设计了 35 个 PD-L1 微型蛋白候选，全部达到实验报告的表达／上样成功标准，29 个获得结合命中，命中率 82.9%。对照其他公开研究，PXDesign 的命中率为 82.4%（14/17），BindCraft 为 77.8%（7/9），Chai-2 为 72.0%（18/25）。按本轮实验的判定标准，成功表达并进入检测的候选里，超过八成拿到了结合命中。

最新实验报告选用的拟合值显示，35 个成功表达的 PD-L1 候选中有 6 个 Kd 低于 10 nM，占比 17.1%。

PD-L1 代表性 SPR 测量曲线。

这 6 个里，5 个候选的 Kd 落在 1 nM 至小于 10 nM 区间，占比 14.3%；另有 1 个达到亚纳摩尔水平。最佳单次 SPR 拟合 Kd 为 0.879 nM。

ProteoCraft 还把目光投向 VHH 纳米抗体——这种蛋白形式在生物医药研发中应用价值不小。微型蛋白的序列通常较短，VHH 不一样：它带有免疫球蛋白样的结构框架，靠三个互补决定区（CDR）参与抗原识别。设计 VHH 时，CDR 环区的构象、与目标表位的结合姿态、CDR 和原有框架之间的结构兼容性，都得一并考虑。

改动 CDR 序列，分子对靶点的识别能力可能变，整体折叠、表达和聚集倾向也可能跟着受影响。

所以纳米抗体设计不能只看局部结合界面能不能形成，还得把整个分子折叠得对不对、能不能表达、稳不稳定一并检查。

IFNAR2 这个靶点上，ProteoCraft 把微型蛋白和 VHH 纳米抗体两条路线都做了一遍。结果是：VHH 纳米抗体在 9 个成功表达的候选里拿到 4 个结合命中，命中率 44.4%；微型蛋白那边，27 个成功表达的候选中有 5 个命中，命中率 18.5%。

两类分子本身的结构差别不小。VHH 纳米抗体带免疫球蛋白样的结构框架，抗原识别主要靠三个互补决定区（CDR）来完成。对这类分子，ProteoCraft 的限定区域设计能力正好有用武之地：模型能保住已有的蛋白框架，同时只对参与识别的局部序列做探索和优化。

样品制备这一环，本轮一共测了 75 个设计，其中 71 个达到了实验报告所采用的表达／上样成功标准，占比 94.7%。

单个候选的结合能力之外，候选彼此之间的序列多样性同样关系到后续研发能有多少选择余地。原因很直接：哪怕某个候选的结合亲和力不错，往下走仍可能卡在稳定性、表达或者别的开发问题上。候选方案留得多，后续优化和挑选才有腾挪空间。

PD-L1 实验的结果也体现出序列上的分散度。按实验报告采用的 80% 全序列相似度阈值和聚类规则，29 个结合命中分出了 29 个序列簇，两两序列相似度的中位数是 28.7%。IFNAR2 VHH 命中候选的序列多样性指标则是 8.7%。

换句话说，本轮实验拿到的结合命中并没有扎堆在少数几个高度相似的序列变体里，后续比较、优化和选择因此可以面对不同的候选方案。

潜在的治疗性分子还要过几道关：生物学功能、生产与开发性质，以及会不会激起不希望出现的免疫反应。拿到结合命中之后，团队就接着看了候选分子在免疫原性相关预测上的表现和潜在脱靶风险，想为后续开发找一个更合适的起点。

免疫原性初筛覆盖了 28 条 PD-L1 和 2 条 IFNAR2 结合阳性候选。团队针对 27 种 HLA-II 分型，用 NetMHCIIpan 与 MixMHC2pred 做交叉评估，同时结合 ImmuScope-IM 预测和实验亲和力数据进行比较。

28 条 PD-L1 结合阳性候选里，Kd 最低的那个分子（0.879 nM）双模型共识呈递密度同样最低，结合亲和力和这项免疫原性相关预测指标两头都占优。

脱靶风险评估纳入 37 条候选，分别跟 9 个相关蛋白、15 个扩展筛查蛋白配对预测，每个配对跑三次取平均。相关蛋白面板中，全部候选的非靶标平均界面评分都低于 0.65。两个面板合起来看，32 条候选（86.5%）在全部非靶标配对中的平均评分低于 0.70；剩下 5 条最高评分约在 0.71—0.76，会被列为后续交叉结合实验的重点复核对象。

这些计算结果给候选比较和下一阶段实验安排添了更多依据，评价范围也从结合亲和力扩到了免疫原性相关特征和潜在脱靶风险。

从实验验证到按需设计，AI 蛋白研发的下一步

眼下这些计算与湿实验的结果，已经为 ProteoCraft 在结合蛋白设计上的应用提供了初步验证。参与这项合作研究的来兮成序（Lexicodon Therapeutics），想走得更远一些：围绕免疫调控需求，探索以功能为起点的蛋白质设计。

来兮成序提的是 「function-first and reasoning-native protein design」 这个理念：先把要实现的生物学功能定清楚，再靠生物学推理去指导分子设计。放到免疫领域，这些目标可以是阻断异常炎症信号、调节免疫细胞活化，或者引导免疫细胞识别特定的靶细胞。

功能目标不同，对分子结合的位置、方式、强度和作用对象的要求也就不一样。围绕这些需求，公司希望把对靶点机制和蛋白相互作用的分析结合起来，让功能目标一步步落成具体的表位选择、结合模式与序列修改约束。

目前来兮成序主要做的是针对指定靶点的结合蛋白从头设计与亲和力优化。再往前走，公司希望用上受约束搜索和局部精修，在保留已有分子框架的同时调整关键区域，让功能、特异性与可开发性要求逐步兼顾。

下一步，团队会通过细胞层面的功能实验，检验候选能不能按预期影响免疫信号和细胞反应，再把实验结果反馈回后续设计。把生物学推理、可控分子设计与功能验证串起来，是来兮成序推动免疫功能蛋白按需研发的长期方向。

代码：https://github.com/smiles724/ProteoCraft_v1

论文：https://github.com/smiles724/ProteoCraft_v1/blob/main/docs/ProteoCraft.pdf