引物设计（Primer Design）
Overview
根据用户提供的核酸序列或 GenBank/NCBI 登录号（accession number），按指定的扩增方法（普通 PCR / 染料法 qPCR / 探针法 qPCR / 等温扩增 RPA·RAA·LAMP）从头设计引物（及探针），完成参数校验 + E-utilities 特异性核验，交付可直接合成下单的序列清单，并可附一份规范的 Word 设计说明文档。适用于不限物种、不限病原的通用场景。
本 Skill 的突出优势（相较通用引物设计）
- 方法全覆盖：普通 PCR、染料法 qPCR、探针法 qPCR、RPA/RAA、LAMP 五种方法，各有独立参数规则文件。
- 参数自动校验：内置
analyze_primers.py一键算 Tm/GC%/二聚体/发夹/3'端稳定性，不合规即提示。 - E-utilities 特异性自动核验：内置
blast_check.py直连 NCBI E-utilities（esearch + esummary），输出命中总数 + top hits + 特异性判定，避免非特异扩增，接口稳定免轮询。 - Word 设计说明文档：内置
make_report.py一键生成含设计依据、参数表、特异性核验结果、下单信息的 .docx。 - 登录号自动抓序列：内置
fetch_sequence.py，用户只给 accession 也能直接开工。 - 可下单交付：附合成下单信息模板（纯化/合成量/修饰/基团搭配），清单可直接交合成公司。
何时使用本 Skill
- 用户给出核酸序列（DNA 或 mRNA/cDNA），要求"设计 PCR / qPCR / RT-qPCR / RPA / RAA / LAMP 引物"。
- 用户只给登录号（如
NM_001234、KU123456、NC_045512），要求按该序列设计引物。 - 用户给出靶基因名或病原名 + 用途，要求设计检测引物/探针。
> 注意区分：本 skill 是从头设计引物。若用户要的是"从文献/标准里检索现成已验证的引物探针序列"，应改走 primer-probe-from-literature skill。
工作流程（Workflow Decision Tree）
输入序列 / 登录号
│
├─ 只有登录号？ → 先用 scripts/fetch_sequence.py 抓取序列
│
├─ 指定用途？
│ ├─ 普通 PCR → 遵循 references/pcr.md
│ ├─ 染料法 qPCR → 遵循 references/qpcr-dye.md
│ ├─ 探针法 qPCR → 遵循 references/qpcr-probe.md
│ ├─ RPA / RAA → 遵循 references/rpa-raa.md
│ └─ LAMP → 遵循 references/lamp.md
│
├─ 设计引物 → scripts/analyze_primers.py 校验参数
│
├─ 特异性核验 → scripts/blast_check.py 做 E-utilities 判定
│
└─ 交付 → 序列清单 + 下单信息(references/order-template.md)
└─ 可选 scripts/make_report.py 生成 Word 说明文档
标准执行步骤
- 获取/确认序列：拿到目标序列（FASTA 或原始序列文本）。若用户只给登录号，用
scripts/fetch_sequence.py抓取；抓取失败则请用户粘贴序列。 - 明确用途与靶区：确认扩增方法、物种、是否跨内含子（RT-qPCR 检测 mRNA 时须跨外显子-外显子接头以防 gDNA 干扰）、目标片段长度。
- 读取对应方法规则：打开
references/下对应方法的 md 文件，严格按其中的参数范围设计。 - 设计引物：生成正向/反向引物（探针法还需探针；LAMP 需 F3/B3/FIP/BIP/LF/LB 全套；RPA/RAA 引物 30–35 nt）。
- 参数校验：用
scripts/analyze_primers.py计算 Tm、GC%、引物二聚体、发夹、3' 端稳定性等关键参数，不符合规则的迭代调整。 - E-utilities 特异性核验：用
scripts/blast_check.py --seq <引物序列> [--org 物种]做特异性判定。判定标准见references/blast-criteria.md。若核验失败，改用 Primer-BLAST 思路人工复核，并在交付时明确标注"特异性核验未完成/需人工复核"。 - 输出交付：
- 序列清单表格（见下方输出规范）+ 下单信息（按references/order-template.md）。
- 可选：用scripts/make_report.py生成 Word 设计说明文档（构造 JSON 后调用）。
输出规范（交付物格式）
引物清单按以下表格输出，字段齐全、可直接交合成公司下单：
| 名称 | 序列 (5'→3') | 长度 | Tm(°C) | GC% | 用途/备注 |
|---|---|---|---|---|---|
- 普通 PCR / qPCR：输出
正向引物 F、反向引物 R（探针法另加探针 Probe，并标注 5'/3' 修饰与淬灭基团）。 - LAMP：输出
F3 / B3 / FIP / BIP / LF / LB六条。 - RPA/RAA：输出
F / R（如需探针则附探针及修饰）。 - 每条引物后附关键质量参数（Tm、GC%、产物大小），并给出设计说明（靶基因、物种、参考序列登录号、跨内含子与否）。
关键质量红线（所有方法通用，违反即需重新设计）
- 引物 3' 末端避免 G/C 过多（≤2 个连续 G/C），3' 末端避免 A/T 成串，降低错配延伸。
- 避免 ≥4 个连续相同碱基（尤其 poly-G/poly-C）。
- 引物自身及引物间二聚体 ΔG 尽可能低（绝对值小），3' 端不要互补。
- 特异性：设计后用
scripts/blast_check.py做 E-utilities 核验，避免非特异扩增。
详细规则与工具
- 各方法参数规则：见
references/下对应文件（pcr.md、qpcr-dye.md、qpcr-probe.md、rpa-raa.md、lamp.md）。 - 合成下单信息模板：
references/order-template.md（纯化/合成量/修饰/基团搭配）。 - 特异性判定标准：
references/blast-criteria.md。 - 序列抓取脚本：
scripts/fetch_sequence.py（输入登录号，输出 FASTA）。 - 引物参数校验脚本：
scripts/analyze_primers.py（输入引物序列，输出 Tm/GC%/二聚体/发夹评估）。 - 特异性核验脚本：
scripts/blast_check.py（基于 NCBI E-utilities 的 esearch + esummary，输出命中总数 + top hits + 判定）。 - Word 说明文档生成脚本：
scripts/make_report.py（输入 JSON 描述，输出 .docx）。示例 JSON 见scripts/example_design.json。
Word 说明文档生成要点
当用户要求"附说明文档/Word 版/设计报告"时，用 scripts/make_report.py 生成 .docx：
1. 把设计结果整理成 JSON（字段见脚本 docstring 或 example_design.json）。
2. 调用 python3 scripts/make_report.py --json <json> --out <输出.docx>。
3. 输出到当前工作区目录（鸿蒙 /tmp 只读，勿用 /tmp）。
4. 文档含五节：设计基本信息 / 引物探针序列清单 / 特异性核验结果 / 合成下单信息 / 注意事项。
